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ibidi實驗方案|如何創(chuàng)建令人驚嘆的細胞球體3D圖像

更新時間:2022-08-19   更新時間:2022-08-19   點擊次數(shù):1480次

  如何創(chuàng)建令人驚嘆的細胞球體3D圖像

  

  第一部分:µ-Slide球體灌注中的球體形成和培養(yǎng)

  

  請在使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 之前閱讀指示。所有步驟均需在無菌條件下執(zhí)行。

  

  開始實驗之前,在標準細胞培養(yǎng)瓶(例如 T75)中制備 L929 成纖維細胞,細胞粘附在底部。細胞在實驗當天應該是健康的并且*佳亞匯合。

  

  重要提示:在 37°C 和 5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)過夜平衡所有必需的材料,例如載玻片、培養(yǎng)基和管道(灌注套件)。平衡對于防止氣泡隨著時間的推移而出現(xiàn)至關重要。


  搜狗截圖22年08月17日1000_1.jpg

  

  1. 將60 µl 無細胞培養(yǎng)基注入 µ-Slide Spheroid Perfusion 的每個通道(根據(jù)說明用提供的蓋玻片封閉)  

  2. 在培養(yǎng)箱中 37°C 孵育 2 小時。孵育期間始終關閉蓋子?! ?/p>

  3. 用 Accutase 處理培養(yǎng)的 L929 細胞 1-2 分鐘以使其脫離?! ?/p>

  4. 收集細胞懸液,離心,在培養(yǎng)基中稀釋;量取決于所需的細胞濃度。  

  5. 對細胞計數(shù)并調(diào)整至終濃度為 5 x 105cells/ml。 

  6. 用無細胞培養(yǎng)基沖洗 µ-Slide 球體灌注的通道,以去除潛在的氣泡?! ?/p>

  7. 將 45 µl 細胞懸液直接移入每個通道?! ?/p>

  8. 在 37°C 下孵育 1 小時,使細胞在壁孔中沉淀?! ?/p>

  9. 用60 µl 無細胞培養(yǎng)基填充 µ-Slide Spheroid Perfusion 的儲液庫?! ?/p>

  10. 在 37°C 下孵育過夜以形成球體?! ?/p>

  11. 檢查通道是否有氣泡。如果通道中存在任何氣泡,請用無細胞培養(yǎng)基小心沖洗通道。  

  12. 使用ibidi 串行連接器連接 µ-Slide Spheroid Perfusion 的 3 個通道  

  13. 根據(jù)ibidi 泵系統(tǒng)、流體單元和灌注裝置指示?! ?/p>

  14. 將µ-Slide 球體灌注連接到 ibidi 泵系統(tǒng)并開始流動。使用盡可能低的流速(5 mBar 氣壓導致流速為 0.74 ml/min)。進行實驗,直到球體具有所需的成熟狀態(tài),在這種條件下培養(yǎng) 7 天后?! ?/p>

  

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  圖1:L929 成纖維細胞在孔中形成球體并在流動條件下培養(yǎng)


3.png

  圖 2:L929 成纖維細胞在µ-Slide 球體灌注中顯示球體形成。第1 天的示例

  

  (A)第 6 天 (B),使用 ibidi 泵系統(tǒng)灌注,0.74 毫升/分鐘。相差顯微鏡,10 倍物鏡,井徑 800 µm。

  

  第二部分:L929 球體的染色和清除

  

  染色直接在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中進行。在開始染色之前,請閱讀指示并遵循載玻片中關于一般移液和更換溶液的建議。

  

  1. 當 L929 球體培養(yǎng)達到所需的成熟狀態(tài)(此處為 7 天后)時,小心地斷開 µ-Slide球體灌注與 ibidi 泵系統(tǒng)的連接?! ?/p>

  2. 在 RT 處用冷 IC 固定緩沖液固定球體 10 分鐘?! ?/p>

  3. 在 RT 中將球體封閉和染色緩沖液中孵育 1 小時?! ?/p>

  4. 在 37°C 下用染色溶液孵育球體過夜。從這一點開始,保持載玻片避光。圖 3A 顯示了清除前的球體成像。  

  5. 第二天,用 Blocking and Staining Buffer 清洗細胞一次?! ?/p>

  6. 通過在冰上以上升 30%、50% 和 70% 的異丙醇稀釋液孵育15 分鐘,依次使球體脫水?! ?/p>

  7.  在冰上用純異丙醇孵育球體兩次 15 分鐘。  

  8.  從冰中取出載玻片,讓它升溫至 RT。  

  9.  執(zhí)行清除:在 RT 處用純 ECi 灌注兩次。在這個階段,球體可以避光儲存數(shù)周,而不會顯著損失熒光?! ?/p>

  10.  使用共聚焦顯微鏡的圖像球體(參見圖 3)?! ?/p>

  

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  圖 3:清除前后染色 L929 球體的共聚焦顯微鏡(紅色:鬼筆環(huán)肽,青色:DAPI)。

  

  (A) 清除前的球體。請注意,由于光散射和吸收,只能看到外圍細胞,而看不到中心的細胞。(B, C) 清除后的球體。請注意,清洗前后的尺寸差異源于脫水和清洗過程,同一位置的橫截面。(B) 橫截面 (C) 體積/3D 視圖。球體的清除允許即使在球體成纖維細胞的中心也可以看到細胞,同時保留球體的形態(tài)。細胞核的計數(shù)甚至可以確定形成該球體的細胞數(shù)。

  

  注:此實驗方案來自ibidi的實際用戶,更多詳情可聯(lián)系本文作者  

  僅供科研使用!

聯(lián)


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